"Expression und Produktion von Weizenspeicherproteinen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae"

Technische Universität Berlin, Mikrobiologie und Genetik, TIB 4/4-1
Prof. Dipl. Ing. Dr. U. Stahl/Dr. Erika Hinzmann

Laufzeit des Vorhabens: 01.02.2000 - 31.01.2005

1. Zielsetzung

In diesem Teilprojekt werden zwei Ziele verfolgt. Erstens sollen durch die Expression von Weizenproteinen in Hefe die Zöliakie-auslösenden Proteine bzw. Proteinbestandteile bestimmt werden. Damit wird die Basis für die Bearbeitung der pflanzengenetischen Fragestellungen des Verbundprojektes geschaffen.

Zweitens sollen kleberähnliche Proteine in Hefe durch Übertragung der entsprechenden Gene aus Weizen in das Genom der Hefe erzeugt werden. Lassen sich auf diesem Weg Kleberproteine herstellen, eröffnet sich ein von Pflanzen unabhängiger Weg, Kleberprotein zu gewinnen. Damit können dann Lebensmittel mit backtechnischen und sensorischen Eigenschaften hergestellt werden, die ansonsten nur Produkte auf Weizenbasis, wie Brot und Teigwaren, aufweisen.

2. Arbeitsprogramm

Zur Überprüfung der Toxizität soll repräsentativ aus jeder Gruppe der an der Kleberbildung beteiligten Weizenproteine ein Gen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Das Gliadin-Gen soll aus der Gruppe der g-Gliadin-codierenden Gene stammen. Gliadine werden als Zöliakie-auslösende Fraktion des Glutens eingestuft. Von den Glutenin-codierenden Genen soll eines aus der Gruppe der LMW-, sowie eine x-HMW- oder eine y-HMW-Untereinheit ausgewählt werden. Dabei ist zu beachten, dass diese Gene keine Sequenzabschnitte enthalten, die im Hinblick auf Zöliakie-Toxizität kritische Aminosäuren codieren.

3. Aktueller Stand der Arbeiten

Die für die Durchführung des Projektes erforderlichen Gene wurden beschafft bzw. isoliert. Das Gen für das g-Gliadin wurde von Charles Hedgcoth, Kansas State University, USA, zur Verfügung gestellt, die Gene für die HMW-Glutenin Untereinheit 1Dx5 und 1Dy10 wurden durch die AG Becker aus genomischer DNA der Weizensorte Cheyenne isoliert und die Gene für LMW-Glutenin Untereinheiten wurden zum einen aus genomischer DNA der Weizensorte Cheyenne zum anderen aus einer cDNA-Genbank der Weizensorte Florida durch die AG Stahl selbst isoliert.

Zur Überprüfung der Zöliakie-Toxizität dieser ausgewählten Speicherproteine wurden die Gene entweder als Ganzes, im Fall des g-Gliadins zusätzlich auch in Teilsequenzen (C- und N-terminaler Bereich getrennt) in verschiedene Hefeexpressionsvektoren eingebracht. Dadurch entstanden Plasmide, mit denen die Gene konstitutiv oder durch Induktion exprimiert und entweder in die Zellmatrix abgegeben oder ins Medium sekretiert werden konnten. Mit diesen Konstrukten wurden verschiedene Hefestämme transformiert und die Proteinproduktion mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page) und anschließender Westernblot-Analyse untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass alle ausgewählten Speicherproteingene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. Im nächsten Schritt wurde begonnen, die Aufreinigungsmethoden (Zellaufschluss und Extraktion) dieser Speicherproteine aus der Zellmatrix von Hefen zu optimieren. Diese isolierten Protein-Rohextrakte werden dann an die AG Wieser zur weiteren Aufreinigung und Charakterisierung weitergegeben, um anschließend von der AG Ciclitira auf ihre Zöliakie-Toxizität überprüft zu werden.

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