"Gentechnische Erzeugung von Weizen ohne Zöliakie-Toxizität"

Universität Hamburg, Institut für Allgemeine Botanik und Botanischer Garten, AMP II
Prof. Dr. H. Lörz/ Dr. D. Becker

Laufzeit des Vorhabens: 01.02.2000 - 31.01.2005

1. Zielsetzung

Das Ziel des Teilprojektes ist die Erzeugung von Weizenpflanzen, deren Endosperm keine Gliadin-Proteine enthält. Hierdurch soll ein neuartiger Weizen ohne Zöliakie auslösendes Potential entstehen.
Dieses Ziel soll durch die gezielte Inaktivierung aller Gliadingene in Weizen erreicht werden. Bei höheren Pflanzen wird hierfür im wesentlichen die Antisense-Technologie und die Co- Suppression angewendet. Allerdings sind beide Techniken hier nicht geeignet, da wiederholt beobachtet wurde, dass in Pflanzen unter bestimmten Umweltsituationen bzw. in nachfolgenden Generationen inhibierte Gene wieder exprimiert werden.
Damit eine dauerhafte Ausschaltung der Zöliakie-Toxizität der Gliadingene erreicht wird, ist die Etablierung eines neuen gentechnischen Verfahrens zur in vivo Mutagenese endogener Gene erforderlich. Vielversprechend erscheinen hier Forschungsergebnisse an tierischen Zellkulturen, aber auch in Mais und Raps. In diesen wurden durch den Einsatz synthetischer RNA/DNA Oligonukleotide gezielt bestimmte Basen innerhalb eines Gens substituiert.
Im Rahmen dieses Teilprojektes sollen zunächst Untersuchungen an einem Modellsystem klären, inwieweit eine in vivo Mutagenesestrategie in Weizen realisierbar ist. Im Erfolgsfall soll anschließend geprüft werden, ob eine in vivo induzierte Basensubstitutition die Expression der Gliadingene in Weizen unterbinden kann.
Zusätzlich soll die Kapazität einer zweiten Technologie, das sogenannte RNAi, auf dessen Potential zur post-transkriptionalen Inhibierung der Gliadingenexpression untersucht werden. Basis für die Arbeitshyphothese einer gezielten Inhibierung der Gliadingentranslation ist die Tatsache, dass die Gliadingene untereinander im 5' Bereich der kodierenden Region eine sehr hohe Homologie zueinander aufweisen.

2. Arbeitsprogramm

Etablierung des Modellsystems
In Weizenprotoplasten wurde ein Genkonstrukt eingebracht, das ein intaktes Antibiotikum-Resistenzgen sowie ein defektes, durch Mutagenese des Translationsstartpunktes nicht-translatierbares Herbizid-Resistenzgen enthält. Nach der Transformation wurden die Kalluskulturen molekularbiologisch charakterisiert (Anzahl integrierter Genkopien, etc.).
Das Ziel ist es, durch in vivo Mutagenese die Punktmutation im Herbizid-Resistenzgen zu korrigieren und die Expression des Selektionsmarkers herzustellen. Die Selektion transformierter Zellen soll dann nach der zweiten Transformation in herbizidhaltigem Kulturmedium durchgeführt werden, gefolgt von der molekularbiologischen Charakterisierung der herbizidresistenten Kalluskulturen.
Für die Umsetzung der RNAi-Technik werden dagegen die entsprechenden Genkonstrukte direkt in Weizen transformiert und die regenerierten, transgenen Pflanzen proteinbiochemisch auf eine Veränderung der Gliadingenexpression untersucht.

3. Aktueller Stand der Arbeiten

In Weizensuspensionszellen wurde ein Transformationsvektor eingebracht, der als Selektionsmarker die Phosphinothrizin-Acetyltransferase (pat) aus Streptomyces hygroscopicus und die Neomycin-Phosphotransferase II (npt II) aus E. coli enthält. Das Genprodukt des pat-Gens vermittelt Resistenz gegen das Herbizid Basta, während das nptII-Gen eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin und dessen Analoga verleiht.. Das Startcodon des pat-Gens wurde durch PCR-Mutagenese so mutiert, dass keine Translation der mRNA erfolgt.

Bislang konnten ca. 180 transgene Zellinien erzeugt werden. Diese wurden auf molekularer Ebene im Southern Blot auf die Existenz des mutierten pat-Gens untersucht. In einer zweiten Transformation werden dann Kalluslinien, die das pat-Gen enthalten, mit synthetischen RNA/DNA Oligonukleotiden transformiert, um durch in vivo Mutagenese die Mutation im Herbizid-Resistenzgen zu korrigieren und die Translation des Selektionsmarkers wieder herzustellen.
Die stabile Transformation von Weizen mit RNAi-Konstrukten wurde begonnen. Hierfür steht zunächst ein Genkonstrukt zur Verfügung. Die Klonierung von zwei weiteren Konstrukten steht kurz vor dem Abschluß, so daß diese mit in die Transformation und Regeneration stabil transformierter Weizenpflanzen einbezogen werden können.

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