"Zöliakiespezifische Toxizitätsprüfung von Proteinen aus transgener Hefe sowie transgenem Weizen und Mais und Detoxifizierung von Weizen durch Immunmodulation"

Dr. H. Wieser
Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie, Garching

Unterauftragnehmer:
Prof. Dr. P. Ciclitira
St.Thomas Hospital, Rayne Institute, London

Laufzeit des Vorhabens: 01.02.2000 - 31.01.2005

1. Zielsetzung

In diesem Teilprojekt werden zwei Ziele verfolgt. Zum einen soll untersucht werden, ob über modifizierte Gliadinpeptide eine Immunmodulation und damit eine orale Toleranz gegenüber Weizen erreicht werden kann. Dazu sollen die Aminosäuresequenzen Zöliakie-toxischer Gliadinpeptide derart modifiziert werden (Teilprojekt 3), dass die synthetischen Peptide zwar an die HLA-Moleküle der immunkompetenten Zellen der Dünndarmschleimhaut binden, gleichzeitig aber die Aktivierung der T-Zellen unterbunden wird. Entsprechend wirksame Peptide sollen dann mittels gentechnischer Maßnahmen in Weizen und Mais transformiert werden (Teilprojekt 1).
Zum anderen soll durch in vivo- und in vitro-Tests eine Auswahl von in transgener Hefe produzierten modifizierten Gliadinen und Untereinheiten von LMW- und HMW-Glutenin, eine Auswahl von synthetischen Peptiden sowie später transgener Weizen und Mais auf Zöliakie-Toxizität geprüft werden.

2. Arbeitsprogramm

Entsprechend der Zielsetzung gliedern sich die Arbeiten in drei Abschnitte:
1 - Immunmodulation:
Für die Versuche zur Immunmodulation werden Bindungsstudien an Antigen-präsentierenden Zellen sowie Stimulationsstudien an T-Zellen durchgeführt werden.
2 - in vitro-Toxizitätsprüfung:
Ein Teil der Toxizitätsprüfungen soll mit in vitro-Tests durchgeführt werden. Aussagekräftig ist der Gewebekultur-Test mit Darmschleimhaut von Zöliakie-Patienten, die in einem Kulturmedium nach Zusatz des zu testenden Proteins oder Peptids inkubiert wird. Nach Abschluss der Inkubation wird als Toxizitätsparameter die Enterocytenhöhe gemessen.
3 - in vivo-Toxizitätsprüfung:
Die in vivo-Toxizitätsprüfung soll an erwachsenen freiwilligen Patienten durch Instillation der zu untersuchenden Substanzen in geringen Mengen (mg-Bereich) in den Dünn- oder Dickdarm vorgenommen werden.

3. Stand der Arbeiten

Die Bindungsstudien an HLA-Zellen (DQ8-Transfektanten von Mäusefibroblasten, DQ2-Transfektanten von humanen B-Lymphozyten) wurden mit biotinylierten synthetischen Peptiden (Teilprojekt 3) aus der N-terminalen Domäne von a-Gliadinen fortgesetzt. Dabei zeigte sich, dass die Affinität der Peptide zu den DQ-Zellen nach Inkubation mit Transglutaminase signifikant gesteigert wurde.
Mit den synthetischen Peptiden wurden Stimulationsversuche mit T-Zellen von zwei Zöliakie-Patienten durchgeführt. Als Maß für die Stimulation wurde der sog. Stimulationsindex (Quotient der Werte aus den Ansätzen mit und ohne Antigen) verwendet. Die Peptide mit nativen Sequenzen aus a-Gliadinen zeigten eine positive Reaktion. Wurde jedoch in bestimmten Sequenzpositionen die jeweilige Aminosäure durch Alanin ersetzt, wurden T-Zellenstimulation und Interferonproduktion unterdrückt.

Für die in-vivo-Toxizitätsprüfung konnten sechs freiwillige Zöliakie-Patienten rekrutiert werden. In einem Vorversuch wurde den nüchternen Patienten mit Hilfe einer Quinton-Ruben-Kapsel Gliadinhydrolysat in das Duodenum instilliert. Dieser Vorversuch ist zwingend, weil das Immunsystem nach glutenfreier Ernährung stimuliert werden muss und für die Untersuchungen nur solche Patienten in Frage kommen, die innerhalb von 6 h auf Gliadin reagieren. Drei Patienten zeigten die erwünschte Wirkung. An ihnen wurde ein von der Arbeitsgruppe 3 synthetisiertes Peptid aus der N-terminalen Domäne von a-Gliadinen auf seine Toxizität untersucht. Als Negativkontrolle wurde ein synthetisches Peptid aus Casein eingesetzt. Das Gliadinpeptid führte bei allen drei Patienten zu einer signifikanten Schädigung des Darmgewebes, während das Caseinpeptid keine Wirkung zeigte.

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